• 实验研究 •
刘洪良,刘晓智,刘振林,姜忠敏,盛凤,李罡
摘要: 目的:研究温度敏感性猿猴病毒40大T抗原(ts-SV40LT)转基因干细胞增殖活性的温度调控机制,为实现脑创伤病人在亚低温治疗期间实施干细胞移植打下基础。方法:用含ts-SV40LT抗原的表达质粒转染人源性脐带间充质干细胞(UCMSCs),PCR方法检测外源基因的整合效率,将其分别置于亚低温(33℃)和正常体温(37℃)两种温度下培养,细胞免疫荧光方法检测增殖细胞核抗原(PCNA)活性,PCR-ELISA端粒酶检测法检测端粒酶活性,流式细胞术检测细胞周期,Western Blot法检测细胞周期调控蛋白——周期素D1(cyclin D1)、CyclinE、周期素依赖性蛋白激酶-2(CDK2)、CDK4、CDK6、P16和P21的蛋白表达情况,免疫荧光方法检测巢蛋白nestin、神经元特异性烯醇化酶(NSE)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达;SPSS13.0软件进行统计学分析。结果:PCR结果显示tsSV40LT抗原的基因片段被成功整合入干细胞,该细胞系在33℃条件下增殖生长旺盛,端粒酶活性高,Cyclin D1、CyclinE、CDK2、CDK4、CDK6均高表达,P16和P21低表达,同时高表达nestin,不表达NSE和GFAP;在37℃条件下细胞增殖缓慢甚至停滞,端粒酶活性低,Cyclin D1、CyclinE、CDK2、CDK4、CDK6的表达强度明显低于33℃条件,P16和P21则相反,与此同时nestin表达强度明显下降,NSE和GFAP表达水平上升。结论:通过tsSV40LT抗原基因的有效转染可实现干细胞在不同温度环境下的增殖调控,为在亚低温条件下实现干细胞移植救治颅脑创伤提供了实验支持。