天津医药

• 细胞与分子生物学 • 上一篇    下一篇

　　　人胰岛素原基因突变导致糖尿病机制的实验研究

张红艳1,崔景秋2,李宁1,刘铭1,冯凭1   

  1. 1. 天津医科大学总医院
    2.
  • 收稿日期:2014-01-20 修回日期:2014-02-26 出版日期:2014-04-15 发布日期:2014-04-15
  • 通讯作者: 张红艳

Study of Mechanism of Proinsulin Gene Mutations in Diabetes Mellitus

  • Received:2014-01-20 Revised:2014-02-26 Published:2014-04-15 Online:2014-04-15

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摘要：

【摘要】 目的 构建几种与人类糖尿病相关的人突变型胰岛素原质粒， 并在大鼠胰岛素瘤细胞 （INS-1） 中进行表达。方法 以野生型人胰岛素原质粒基因PCMS-EGFP/HWT为模板， 设计并合成引物， 利用定点突变技术， PCR 生成PCMS-EGFP/H-C(B19)G、 H-L(B11)P、 H-R(S6)C、 H-F(B25)L 4种单点突变质粒， 对每个质粒进行序列测定验证定点突变成功， 用脂质体2000将上述野生型、 4种突变型质粒及空质粒分别转染INS-1细胞， 放射免疫法检测各细胞培养液中人胰岛素水平。结果 序列测定证实上述质粒定点突变成功, H-C(B19)G、 H-L(B11)P、 H-R(S6)C 3组突变细胞培养液中胰岛素水平低于野生型和H-F(B25)L组 （P＜0.05）， 与空质粒组差异无统计学意义， 且3组彼此间差异无统计学意义； H-F(B25)L组与野生型差异无统计学意义 （P＞0.05）。 结论 成功构建并表达4种突变型人胰岛素原质粒， 不同突变型胰岛素原可能通过不同机制导致糖尿病。

关键词: 内质网应激, 胰岛素原错误折叠, 诱变, 定点, 质粒, 永久性新生儿糖尿病, 转染, B细胞功能衰竭

Abstract: 　　　Abstract Objective: To construct several human proinsulin mutants related to diabetes and express in INS-1 cell. Methods: Human mild proinsulin gene as template ,use site-directed mutagenesis，generate four human proinsulin mutants by PCR，sequence each mutant，transfect four mutants、empty plasmid and mild plasmid into INS-1 cell by liposome 2000，determine insulin values in each cell solution by radioimmunoassay. Results: Proinsulin mutants are confirmed by sequence determination ,insulin values in culture solution of H-C(B19)G、 H-L(B11)P、H-R(S6)C mutants are less than that of wild type and found no significant differences statistically with empty plasmid. insulin values of H-F(B25)L is more than that of empty plasmid and the former three mutants. Conclusions: Successfully construct and express four human proinsulin mutants, different mutants result in diabetes through different mechanism.

Key words: 　Endoplastic reticulum stress, Proinsulin misfolding, mutagenesis, site-directed, plasmids, permanent neonatal diabetes mellitus, transfection, B细胞功能衰竭