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p100蛋白慢病毒干扰载体及p100沉默的HepG2稳定细胞系的构建
黄丽1 ,尹洁2 ,丁建民3 ,宋娟1 ,支蕾4 ,何津岩1 ,张毅1 ,高星杰2 ,经翔3 ,杨洁1
2012, 40 (6):
529-532 .
摘要
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目的:用表达shRNA的干扰慢病毒载体系统建立p100基因稳定沉默的HepG2人肝癌细胞系。方法:通过RNAi序列设计软件进行p100干扰片段设计,筛选出p100基因的RNAi有效靶序列,进一步合成靶序列的Oligo DNA并构建pLKO.3G-p100I慢病毒载体,用双酶切及测序进行鉴定。将构建好的p100 shRNA表达质粒与慢病毒包装质粒共转染至包装细胞293T,包装产生病毒颗粒。运用病毒颗粒感染HepG2细胞,获得p100稳定沉默的细胞系。荧光显微镜下观察感染效率,利用Western blot方法检测稳定细胞株中p100的沉默效果。结果:成功构建了具有p100干扰效果的慢病毒载体,并获得了稳定沉默p100及对照的HepG2细胞株。慢病毒感染HepG2细胞后,荧光显微镜下观察到90%以上细胞发出绿色荧光,Western blot实验证实干扰p100后,HepG2细胞株中p100蛋白表达水平显著降低。结论:成功构建了具有p100干扰效果的慢病毒干扰载体及p100稳定沉默的HepG2细胞系。
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